Team:CIDEB-UANL Mexico/Safety-ProjectDocument/Español

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<p align="justify"><br>The organism used in the project is E. Coli, which has risk group or biosafety level of one. That means that is unlikely to cause human or animal disease and, therefore, it is safe to use. The protein that is going to be synthetized derived for beauveria bassiana and it also belongs to the risk group one. Like any micro-organism, B. bassiana has the potential to act as an opportunistic pathogen, but as the literature study demonstrates, Beauveria infections are extremely rare events. Anyway, there is no need to work directly with, B. bassiana because is just an organisms from which the insecticidal part is derived.<br><br>There are also some potential risks for the team members while they are working in the laboratory. The laboratory used is a basic biosafety level one only used for basic teaching and research; it is an open bench work. The only risk in this laboratory is that the team members do not follow the security rules for every laboratory causing an accident. If the project result as it is supposed to do, it must not be a danger for any public if the product is not ingested. If it is ingested, E. Coli will cause diarrhea and a little fever depending the patient.<br><br>About the environmental impact, the bacteria is modificate in order to cause the death of plague insects, that means that the population of the plague will be reduced, affecting in one or another way, a change in the environment. The insecticidal also can affect some species of the same family but not all, it is difficult to predict its impact and danger because of the lack of information about this novel insecticide, but one we discover what other insects are exposed to the insecticide, we will be able to determine the amount that will be affected by it.<br><br>The risk of an accident inside the laboratory depends of the lever of care that the team members have during the practices. The biological parts and organisms represent a risk if they enter in contact with a body. We are working with E. coli strains that are specifically weakened for laboratory use. On the other hand, there are some equipment and chemicals that represent a danger if they are not used correctly. Some chemicals used in laboratory represent a safety risk so all members of the team were told to handle them with extreme care. The same goes for the lab equipment; some cannot be used without a responsible authorization.<br><br>We are you addressing these issues in our project design and lab work by taking precautions and using safety equipment in order to prevent an accident. Every member of the team is aware of the risk that means work in the laboratory. Each one know about the security rules during a laboratory practice because we have had biosafety training before the real practices even started. On it we learned about the correct procedures to carry out any experiment; and also about some security precautions referring the material that we were going to use. When using ethidium bromide (risks include: irritant to eyes, skin, mucus, and respiratory tract) we make sure the designated research zone is properly closed and we use the necessary protection. When observing stained DNA, through the use of UV rays, we use special protection for the eyes. While managing electrical devices and circuits, all members of the team were told to handle them with extreme care. This training was in order to prevent accidents and for the success of the project.</p>
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<p align="justify"><b>Ensayo de Bioseguridad</b><br>El organismo utilizado en el proyecto es la E. Coli, que tiene el grupo de riesgo o nivel de bioseguridad de uno. Eso significa que es poco probable que cause enfermedad en seres humanos o animales y, por lo tanto, es seguro de usar. La proteína que se va a ser sintetizada es derivada de Beauveria bassiana y que también pertenece al grupo de riesgo uno. Al igual que cualquier microorganismo, B. bassiana tiene el potencial de actuar como un patógeno oportunista, pero como el estudio de la literatura demuestra, que infecciones de Beauveria son eventos muy raros. De todos modos, no hay necesidad de trabajar directamente con, B. bassiana, porque es sólo un organismos de los que se deriva la parte insecticida.<br><br>También existen algunos riesgos potenciales para los miembros del equipo mientras trabajan en el laboratorio. El laboratorio utilizado es un elemento básico de bioseguridad de nivel uno sólo se utiliza para la enseñanza básica y la investigación, es un banco de trabajo abierto. El único riesgo en este laboratorio es que los miembros del equipo no siguen las reglas de seguridad para todos los laboratorios de evitar causar un accidente. Si el resultado del proyecto, ya que se supone que debe hacer, no debe ser un peligro para cualquier público, si el producto no se ingiere. Si es ingerido, E. Coli causaría diarrea y un poco de fiebre dependiendo del paciente.<br><br>Sobre el impacto ambiental, la bacteria es modificada con el fin de causar la muerte de los insectos plaga, lo que significa que se reducirá la población de la plaga, que afecta de una u otra manera, un cambio en el medio ambiente. El insecticida también puede afectar a algunas especies de la misma familia, pero no todos, es difícil predecir el impacto y el peligro debido a la falta de información acerca de este nuevo insecticida, pero lo que descubramos acerca de los insectos que están expuestos al insecticida, lo haremos al determinar la cantidad que se verá afectado por el mismo.<br><br>El riesgo de un accidente en el laboratorio depende de la atención que los miembros del equipo tienen durante las prácticas. Las partes biológicas y organismos representan un riesgo si entran en contacto con el cuerpo. Estamos trabajando con las cepas de E. coli que se debilitan específicamente para uso en laboratorio. Por otro lado, existen algunos equipos y los productos químicos que representan un peligro si no se utilizan correctamente. Algunos productos químicos utilizados en el laboratorio representan un riesgo de seguridad para todos los miembros del equipo por eso se nos dio la instrucción de utilizar el material con el cuidado necesario. Lo mismo ocurre con los equipos de laboratorio, algunos no se pueden utilizar sin autorización de responsables.<br><br>Nos están abordando estas cuestiones en nuestro diseño del proyecto y el trabajo de laboratorio tomando las precauciones y el uso de equipo de seguridad a fin de evitar un accidente. Cada miembro del equipo es consciente del riesgo que significa el trabajo en el laboratorio. Cada uno sabe sobre las reglas de seguridad durante una práctica de laboratorio, ya que hemos tenido capacitación en bioseguridad ante las prácticas reales, incluso comenzadas. En ella hemos aprendido acerca de los procedimientos adecuados para llevar a cabo cualquier experimento, y también sobre algunas medidas de seguridad que se refieren el material que íbamos a utilizar. Cuando se usa bromuro de etidio (riesgos incluyen: Irritante para los ojos, la piel, mucosa y las vías respiratorias) nos aseguramos de la zona de investigación designada esté bien cerrada y se utiliza la protección necesaria. Al observar el ADN de colores, mediante el uso de los rayos UV, se utiliza una protección especial para los ojos. Mientras que la gestión de aparatos eléctricos y circuitos, todos los miembros del equipo se les dijo que manejarlos con mucho cuidado. Esta formación fue con el fin de evitar accidentes y para el éxito del proyecto.</p>
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<p align="justify"><b>Environment Safety of the VIP3</b><br>The proteins of Vip3 are original from the bacteria Bacillus thuringiensis. Vip proteins have pesticide properties against some plagues from the family of the lepidopteron. This document seeks to make a collection of information and data relevant to the overall assessment of the environmental hazard of the protein Vip3Ca3 when it is produced in genetically modified organisms as E.Coli and the GM corn plant.<br><br>Bacillus thuringiensis is a soil bacterium although is found throughout the environment. The protein pesticides produced by B. thuringiensis show a great variety with regard to the mode of action, the specificity of the objective and the mechanism of expression. Pesticide proteins expressed by the strains of B. thuringiensis include antifungal compounds, δ-exotoxinas,3 and δ-endotoxins, which include the protein Cry and Cyt, that are not structurally related but come from the same bacterium. The Cry proteins are so named because it is stored as parasporals crystals during the formation of the spore, unlike the new protein that was produced by B. thuringiensis during their vegetative phase of growth, in addition to during the stage of sporulation, so that was called vegetative insecticidal protein (Vip). In addition, while the Cry proteins are isolated as crystals, the Vip proteins are secreted by bacteria and can be isolated directly from the culture medium.<br><br>It has been determined that, in reality, there are several variants of Vip which are classified into three classes according to the similarity of the aminoacid sequence: Vip1, Vip2 and Vip3. Of these, the group whose insecticidal properties are more efficient is the Vip3. The members of the Vip3 family characterized to date exhibit activity against lepidopterans, and several of them do not compete with Cry proteins for binding sites. They are classified into two subfamilies (Vip3A and Vip3B), and some are especially toxic for species with little susceptibility to several Cry proteins. All of these features have made Vips a research target for broadening the host-range of B. thuringiensis-based biopesticides and for the management of insect resistance to B. thuringiensis proteins.</p>
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<p align="justify"><b>Relation between Vip3A and Vip3C</b><br>The taxonomic group of proteins that Vip is currently used in the production of GM crop plants resistant to insects is Vip3Aa. Vip3Aa1 may vary in size from 62 to 66 kDa among different Vip3 proteins and is occasionally known as the “trypsin-resistant core". Also, Vip3C proteins maintained only one of the three residues of the C terminus stabilizing domain described for Vip3Aa1 (5). This higher divergence toward the C terminus might indicate lower functional constraints and, consequently, more permissibility to nonsynonymous substitutions.<br><br>For a preliminary screening of the insecticidal properties of Vip3Ca (host range and toxicity), Vip3Ca3 was picked because of its high yields, expressed in Escherichia coli, column purified, quantified by densitometry, and used to challenge larvae of 10 different lepidopteran species. Bioassays were conducted with neonate larvae that were placed over a surface-contaminated artificial diet. It has been given considerable attention to the possible impacts of the proteins of B. thuringiensis in the Monarch Butterfly (Danaus plexippus), which is not a lepidopter pest in North America. Studies have shown that the proteins Vip3Aa are not toxic to this species of butterfly. However, the differences between the Vip3A and the Vip3C are such that is not possible to determine exactly the toxicity of the pesticide for the butterfly without making proves.<br><br>Preliminary bioassays of larvae from 10 different lepidopteron species indicated that Vip3Ca3 caused more than 70% mortality in four species after 10 days at 4 g/cm2. How the few changes in the Vip3Ca proteolytic processing sites may modify either the protein activity or the host range is uncertain, but different Vip3 proteins have shown very distinct insecticidal properties. For example, two of the species tested showed very low susceptibility to Vip3Ca3. One of them was Ostrinia nubilalis, for which no toxic effects of any of the Vip3Aa proteins assayed so far have been reported. The other one was L. botrana, which has been challenged with Vip3 for the first time.</p>
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<p align="justify"><b>Bioseguridad Ambiental respecto al Vip3</b><br>Las proteínas de Vip3 son originales de la bacteria Bacillus thuringiensis. Las proteínas Vip tienen propiedades pesticidas contra algunas plagas de la familia de los lepidópteros. Este documento pretende hacer una recopilación de información y datos relevantes para la evaluación general del riesgo ambiental de la proteína Vip3Ca3 cuando se produce en organismos modificados genéticamente como E. Coli y la planta de maíz GM.<br><br>Bacillus thuringiensis es una bacteria del suelo, aunque se encuentra en todo el entorno. Los pesticidas proteicos producidos por B. thuringiensis muestran una gran variedad en relación con el modo de acción, la especificidad del objetivo y el mecanismo de expresión. Proteínas plaguicidas expresadas por las cepas de B. thuringiensis incluyen compuestos antifúngicos, δ-exotoxinas, 3 y δ-endotoxinas, que incluyen la proteína Cry y Cyt, que no están Bacillus thuringiensis es una bacteria del suelo, aunque se encuentra en todo el entorno. Los pesticidas proteicos producidos por B. thuringiensis muestran una gran variedad en relación con el modo de acción, la especificidad del objetivo y el mecanismo de expresión. Proteínas plaguicidas expresadas por las cepas de B. thuringiensis incluyen compuestos antifúngicos, δ-exotoxinas, 3 y δ-endotoxinas, que incluyen la proteína Cry y Cyt, que no están estructuralmente relacionados sino que provienen de la misma bacteria. Las proteínas Cry se llaman así porque se almacenan en forma de cristales paraesporales durante la formación de la espora, a diferencia de la nueva proteína que fue producida por B. thuringiensis durante su fase vegetativa de crecimiento, además de durante la etapa de esporulación, así que fue llamada proteína insecticida vegetativa (Vip). Además, mientras que las proteínas Cry se aíslan en forma de cristales, las proteínas VIP son secretadas por las bacterias y se pueden aislar directamente del medio de cultivo. relacionados sino que provienen de la misma bacteria. Las proteínas Cry se llaman así porque se almacenan en forma de cristales paraesporales durante la formación de la espora, a diferencia de la nueva proteína que fue producida por B. thuringiensis durante su fase vegetativa de crecimiento, además de durante la etapa de esporulación es donde fue llamada proteína insecticida vegetativa (Vip). Mientras que las proteínas Cry se aíslan en forma de cristales, las proteínas VIP son secretadas por las bacterias y se pueden aislar directamente del medio de cultivo.<br><br>Se ha determinado que, en realidad, hay diversas  variantes de Vip que se clasifican en tres clases de acuerdo a la similitud de la secuencia de aminoácidos: VIP1, VIP2 y Vip3. De éstos, el grupo cuyas propiedades insecticidas son más eficientes es el Vip3. Los miembros de la familia Vip3 caracterizado hasta la fecha muestran actividad contra lepidópteros, y varios de ellos no compiten con las proteínas Cry de sitios de unión. Se clasifican en dos subfamilias (Vip3A y Vip3B), y algunos son especialmente tóxicos para las especies con poca susceptibilidad a varias proteínas Cry. Todas estas características han hecho Vips con un objetivo de investigación para la ampliación de la gama de huéspedes de B. thuringiensis para bioplaguicidas basados en y para la gestión de la resistencia de los insectos a proteínas de B. thuringiensis.</p>
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<p align="justify"><b>Mechanism of the insecticidal activity of Vip3</b><br>A prerequisite for the insecticidal activity of Vip3Aa is a enzymatic proteolysis that is found in the intestine of the insect. Curiously, the VIP3 proteins are processed by the fluids in the intestine of the insect and arrive to the active form regardless of if the insect is susceptible to the toxin. Once the Vip3 protein is found in the active form, it joins the vesicular membrane of the mucosa of the midget of susceptible species. The site of union is not the same site in the different types of vip3 and connection to the intestine is correlated with toxicity.<br><br>After the union, Vip3 causes paralysis of the bowel, followed by the lysis of the epithelial cells of the intestine, allegedly because of an interference of the transmembrane potential, resulting in the death of cells. The activated protein can form transmembrane pores, and it is considered that these pores contribute to lysis and death of the epithelial cells of the medium intestine.</p>
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<p align="justify"><b>Probes in non-target organism (NTO)</b><br>There have been probes of some Vip3 proteins to determine their environmental damage, specifically to see if they are a risk against not pest organisms. Only the Vip3Aa have been used in GM plants and based on the information recovered, it is possible to make inferences about the general effects of Vip3, but remembering that the properties change in different branches of Vip. The proteins Vip3Aa have insecticidal properties against insect’s lepidopterans, and when used in genetically modified crops, the proteins are aimed at lepidopterans pests of insects to reduce the damage food. They are called non-target organism (NTO) to the agencies of the environment, directly or indirectly exposed to proteins Vip, which are not pests in the agricultural system.<br><br>Direct exposure occurs when the braids are fed of tissues of live cultures or crop wastes that are on the ground or on the floor. The indirect exposure occurs when an organism feeds on another agency that has consumed tissues of plants that contain proteins Vip3. Have been submitted the data to show that the much exposed to the protein Vip3Aa in the environment, either directly or indirectly, they do not suffer damage. Regulatory decisions have been derived from the broad history of the use of insecticides for microbes formulations of B. thuringiensis, as well as the collected data from field tests of GM crops that produce one of the proteins Vip3Aa. These data have established that the proteins Vip3Aa are specifically active against the subgroup of Lepidoptera pests that consume the crop and that they are safe to vertebrate species and other NTO. However, because the experiment was realized with with Vip3Aa is could be a different behavior of Vip3Ca3.</p>
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<p align="justify"><b>Relación entre Vip3A y Vip3C</b><br>El grupo taxonómico de proteínas que Vip se utiliza actualmente en la producción de plantas de cultivos transgénicos resistentes a los insectos es VIP3Aa. Vip3Aa1 puede variar en tamaño de 62 a 66 kDa entre diferentes proteínas Vip3 y en ocasiones se conoce como el "núcleo resistente a tripsina". Además, las proteínas Vip3C mantienen sólo uno de los tres residuos de estabilizar el dominio C terminal descrito para Vip3Aa1 (5). Este mayor divergencia hacia el extremo C-terminal podría indicar limitaciones funcionales más bajos y, en consecuencia, más que la permisibilidad de sustituciones no sinónimas.<br><br>Para una selección preliminar de las propiedades insecticidas del Vip3Ca (rango de hospederos y toxicidad), Vip3Ca3 fue elegido debido a sus altos rendimientos, expresados en Escherichia coli, se purificó en columna, cuantificados por densitometría, y se utiliza para desafiar las larvas de 10 especies de lepidópteros diferentes. Los bioensayos se realizaron con larvas neonatas que se colocaron sobre una superficie contaminada con dieta artificial. Se ha prestado mucha atención a los posibles efectos de las proteínas de B. thuringiensis en la mariposa monarca (Danaus plexippus), que no es un lepidóptero plaga en América del Norte. Los estudios han demostrado que la VIP3Aa proteínas no son tóxicos para esta especie de mariposa. Sin embargo, las diferencias entre la Vip3A y la Vip3C son tales que no es posible determinar exactamente la toxicidad del plaguicida para la mariposa sin hacer prueba. Bioensayos preliminares de larvas de 10 especies de lepidópteros diferentes indicaron que Vip3Ca3 causó más de 70% de mortalidad en cuatro especies después de 10 días a 4 g/cm2. Pocos cambios en los sitios de procesamiento proteolítico Vip3Ca pueden modificar o bien la actividad de la proteína o la gama de huéspedes es incierto, pero diferentes proteínas Vip3 han demostrado propiedades insecticidas muy distintas. Por ejemplo, dos de las especies sometidas a prueba mostraron muy baja susceptibilidad a la Vip3Ca3. Uno de ellos era Ostrinia nubilalis, para el que no hay efectos tóxicos de cualquiera de las proteínas VIP3Aa que ensayaron hasta ahora han sido reportados. El otro era de L. botrana, que ha sido desafiado con Vip3 por primera vez.</p>
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<p align="justify"><b>Environmental exposure pathways</b><br>Regulatory decisions, generally, take into account three main routes of exposure in addition to the direct contact with the plant or bacteria that expresses one of the VIP3 protein: exposure to pollen contains vip3, exposure to the VIP3 deposited on the ground by the material object in decomposition, and exposure tritrofic through herbivores that feed on the plant or bacteria with the protein.<br><br>In some countries like the United States, require data related to the longevity of the Bt proteins in the soil, and the data suggest that Vip3Aa degrades quickly once freed of the plant tissue in decomposition, which is not likely to persist or accumulate in the soil environment.<br<br>Regulatory authorities have considered the potential impact of the protein Vip3Aa in natural populations of braids and determined that the adverse effects on are unlikely in NTO for various reasons. At first, the proteins Vip3Aa have a narrow spectrum of pesticide activity but there is not information that confirms the same occur with all Vip3 proteins. Second, in studies of level I has been also demonstrated that proteins Vip3Aa have no observable effect on aquatic vertebrate species nor representative. Fourth, the levels of Vip3Aa used in these tests of level I were much higher than those measured in the production a plants and bacteria.<br><br>In addition when compared with the control of insects through vip3, the usual insect control, which uses chemical pesticides, alters the diversity of species in a meaningful way and damage species NTO. But it is not prudent to forget the large time effects that Vip3 can have in immediately depredators of the plagues.</p>
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<p align="justify"><b>Conclusion</b><br>Vegetative insecticidal proteins (Vip) are secret able proteins from Bacillus thuringiensis which do not share sequence homology with known Cry proteins and display insecticidal activity against a wide variety of lepidopterans and coleopterans and some sap-sucking insect pests. Field studies suggest that the cultivation of plants and other producers that express Vip3 does not affect the abundance of non-target arthropods, with the possible exception of the specific predators of pests. Together, these findings indicate that it is unlikely that the proteins Vip3Aa will have adverse effects in natural populations of organisms, except for the crop pest lepidopterans, and probably there would be similar results in general for similar Vip3 proteins.</p>
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<p align="justify"><b>Mecanismo de la actividad insecticida de Vip3</b><br>Un requisito previo para la actividad insecticida de Vip3Aa es una proteolisis enzimática que se encuentra en el intestino del insecto. Curiosamente, las proteínas Vip3 se procesan por los fluidos en el intestino del insecto y llegan a la forma activa, independientemente de si el insecto es susceptible a la toxina. Una vez que la proteína Vip3 se encuentra en la forma activa, que se une a la membrana vesicular de la mucosa de la enana de las especies sensibles. El sitio de unión no es el mismo sitio en los diferentes tipos de Vip3 y la conexión con el intestino se correlaciona con la toxicidad. Después de la unión, Vip3 causa parálisis del intestino, seguido por la lisis de las células epiteliales del intestino, supuestamente a causa de una interferencia del potencial transmembrana, lo que resulta en la muerte de las células. La proteína activada puede formar poros transmembrana, y se considera que estos poros contribuyen a la lisis y la muerte de las células epiteliales del intestino medio.</p>
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<p align="justify"><b>Sondas en organismos no objetivo (ONT)</b><br>Ha habido sondas de algunas proteínas Vip3 para determinar su daño ambiental, específicamente para ver si son un riesgo para los organismos o plagas. Sólo el Vip3Aa se han utilizado en plantas modificadas genéticamente y sobre la base de la información recuperada, es posible hacer inferencias acerca de los efectos generales de Vip3, pero recordando que el cambio de propiedades en diferentes ramas de Vip. Las proteínas Vip3Aa tienen propiedades insecticidas contra lepidópteros del insecto, y cuando se utiliza en los cultivos modificados genéticamente, las proteínas se dirigen a plagas  de insectos lepidópteros para reducir el daño de los alimentos. Se denominan organismos no objetivos (ONT) a los organismos de medio ambiente, directa o indirectamente expuesta a las proteínas Vip, que no son plagas en el sistema agrícola.<br><br>La exposición directa se produce cuando las trenzas se alimentan de los tejidos de cultivos vivos o desechos de los cultivos que se encuentran en el suelo o en el subsuelo. La exposición indirecta ocurre cuando un organismo se alimenta de otro organismo que ha consumido a los tejidos de las plantas que contienen proteínas Vip3. Se han presentado los datos para mostrar que algunos organismos expuestos a la proteína VIP3Aa en el medio ambiente, ya sea directa o indirectamente, no sufran daños. Las decisiones regulatorias se han derivado de la amplia historia de la utilización de insecticidas para las formulaciones de los microbios de B. thuringiensis, así como los datos recopilados de las pruebas de campo de cultivos transgénicos que producen uno de las proteínas VIP3ca3. Estos datos han demostrado que las proteínas Vip3Aa son especialmente activos contra el subgrupo de plagas de lepidópteros que consumen los cultivos y que son seguros para las especies vertebradas y otros ONT. Sin embargo, debido a que el experimento se realizó con Vip3Aa es que podría ser un comportamiento diferente de Vip3Ca3.</p>
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<p align="justify"><b>Vías de exposición del medio ambiente</b><br>Las decisiones reguladoras, en general, tienen en cuenta tres rutas principales de la exposición, además del contacto directo con la planta o bacteria que expresa una de las proteínas Vip3: la exposición al polen contiene Vip3, la exposición a la Vip3 depositada en el suelo por el material del objeto en descomposición y exposición a través de los herbívoros que se alimentan de la planta o bacteria con la proteína.<br><br>En algunos países como los Estados Unidos, requieren datos relacionados con la longevidad de las proteínas Bt. en el suelo, y los datos sugieren que Vip3Aa se degrada rápidamente una vez liberado del tejido vegetal en descomposición, que no es probable que persista o acumularse en el suelo. Autoridades reguladoras han considerado el impacto potencial de la proteína VIP3Aa en poblaciones naturales de las trenzas y determinaron que los efectos adversos son en poco probable en las ONT, por diversas razones. Al principio, las proteínas Vip3Aa tienen un estrecho espectro de actividad plaguicida, pero no hay información que confirma que lo mismo ocurre con todas las proteínas Vip3. En segundo lugar, en los estudios de nivel I se ha demostrado también que las proteínas Vip3Aa tiene ningún efecto observable sobre las especies de vertebrados acuáticos ni representativos. En cuarto lugar, los niveles de Vip3Aa utilizados en estas pruebas de nivel I eran mucho más altos que los medidos en la producción de plantas y bacterias.<br<br>Además, en comparación con el control de los insectos a través de vip3, el control de insectos de costumbre, que utiliza pesticidas químicos, altera la diversidad de las especies de una manera significativa y daños a especies ONT. Pero no es prudente olvidar los grandes efectos del tiempo que Vip3 puede tener en forma inmediata depredadores de las plagas.</p>
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<p align="justify"><b>Conclusión</b><br>Proteínas insecticidas vegetativas (VIP) son proteínas capaces  de Bacillus thuringiensis que no comparten homología de secuencia con proteínas Cry conocidas y muestran actividad insecticida contra una amplia variedad de lepidópteros y coleópteros y algunas plagas de insectos chupadores de savia. Estudios de campo indican que el cultivo de plantas y otros productores que expresan Vip3 no afecta a la abundancia de los artrópodos que no son plagas, con la posible excepción de los depredadores de las plagas específicas. En conjunto, estos resultados indican que es poco probable que las proteínas Vip3Aa tengan efectos negativos en las poblaciones naturales de organismos, con excepción de las plagas de lepidópteros de los cultivos, y probablemente no habría resultados similares en general para proteínas similares Vip3.</p>
<p align="justify">1.Revisión de la seguridad ambiental de Vip3Aa. Center for Environmental Risk Assessment, ILSI Research Foundation. July 15th, 2012.<br>2.Vip3, a novel class of vegetative insecticidal proteins from Bacillus Thuringiensis. Instituto de Agrobiotacnología CSIC-UPNA, Spain, 2012.<br>3.Ministerio de agricultura, alimentación y medioambiente.<br>4.http://www.glfc.forestry.ca/bacillus/BtSearch.cfm(The Bacillus thuringiensis toxin specificity database)<br>5.http://cfs.nrcan.gc.na/projects/119/2(The Bacillus thuringiensis toxin project)</p>
<p align="justify">1.Revisión de la seguridad ambiental de Vip3Aa. Center for Environmental Risk Assessment, ILSI Research Foundation. July 15th, 2012.<br>2.Vip3, a novel class of vegetative insecticidal proteins from Bacillus Thuringiensis. Instituto de Agrobiotacnología CSIC-UPNA, Spain, 2012.<br>3.Ministerio de agricultura, alimentación y medioambiente.<br>4.http://www.glfc.forestry.ca/bacillus/BtSearch.cfm(The Bacillus thuringiensis toxin specificity database)<br>5.http://cfs.nrcan.gc.na/projects/119/2(The Bacillus thuringiensis toxin project)</p>

Revision as of 07:05, 21 June 2013

Bioseguridad
Bioseguridad del Proyecto

Ensayo de Bioseguridad
El organismo utilizado en el proyecto es la E. Coli, que tiene el grupo de riesgo o nivel de bioseguridad de uno. Eso significa que es poco probable que cause enfermedad en seres humanos o animales y, por lo tanto, es seguro de usar. La proteína que se va a ser sintetizada es derivada de Beauveria bassiana y que también pertenece al grupo de riesgo uno. Al igual que cualquier microorganismo, B. bassiana tiene el potencial de actuar como un patógeno oportunista, pero como el estudio de la literatura demuestra, que infecciones de Beauveria son eventos muy raros. De todos modos, no hay necesidad de trabajar directamente con, B. bassiana, porque es sólo un organismos de los que se deriva la parte insecticida.

También existen algunos riesgos potenciales para los miembros del equipo mientras trabajan en el laboratorio. El laboratorio utilizado es un elemento básico de bioseguridad de nivel uno sólo se utiliza para la enseñanza básica y la investigación, es un banco de trabajo abierto. El único riesgo en este laboratorio es que los miembros del equipo no siguen las reglas de seguridad para todos los laboratorios de evitar causar un accidente. Si el resultado del proyecto, ya que se supone que debe hacer, no debe ser un peligro para cualquier público, si el producto no se ingiere. Si es ingerido, E. Coli causaría diarrea y un poco de fiebre dependiendo del paciente.

Sobre el impacto ambiental, la bacteria es modificada con el fin de causar la muerte de los insectos plaga, lo que significa que se reducirá la población de la plaga, que afecta de una u otra manera, un cambio en el medio ambiente. El insecticida también puede afectar a algunas especies de la misma familia, pero no todos, es difícil predecir el impacto y el peligro debido a la falta de información acerca de este nuevo insecticida, pero lo que descubramos acerca de los insectos que están expuestos al insecticida, lo haremos al determinar la cantidad que se verá afectado por el mismo.

El riesgo de un accidente en el laboratorio depende de la atención que los miembros del equipo tienen durante las prácticas. Las partes biológicas y organismos representan un riesgo si entran en contacto con el cuerpo. Estamos trabajando con las cepas de E. coli que se debilitan específicamente para uso en laboratorio. Por otro lado, existen algunos equipos y los productos químicos que representan un peligro si no se utilizan correctamente. Algunos productos químicos utilizados en el laboratorio representan un riesgo de seguridad para todos los miembros del equipo por eso se nos dio la instrucción de utilizar el material con el cuidado necesario. Lo mismo ocurre con los equipos de laboratorio, algunos no se pueden utilizar sin autorización de responsables.

Nos están abordando estas cuestiones en nuestro diseño del proyecto y el trabajo de laboratorio tomando las precauciones y el uso de equipo de seguridad a fin de evitar un accidente. Cada miembro del equipo es consciente del riesgo que significa el trabajo en el laboratorio. Cada uno sabe sobre las reglas de seguridad durante una práctica de laboratorio, ya que hemos tenido capacitación en bioseguridad ante las prácticas reales, incluso comenzadas. En ella hemos aprendido acerca de los procedimientos adecuados para llevar a cabo cualquier experimento, y también sobre algunas medidas de seguridad que se refieren el material que íbamos a utilizar. Cuando se usa bromuro de etidio (riesgos incluyen: Irritante para los ojos, la piel, mucosa y las vías respiratorias) nos aseguramos de la zona de investigación designada esté bien cerrada y se utiliza la protección necesaria. Al observar el ADN de colores, mediante el uso de los rayos UV, se utiliza una protección especial para los ojos. Mientras que la gestión de aparatos eléctricos y circuitos, todos los miembros del equipo se les dijo que manejarlos con mucho cuidado. Esta formación fue con el fin de evitar accidentes y para el éxito del proyecto.

Bioseguridad Ambiental respecto al Vip3
Las proteínas de Vip3 son originales de la bacteria Bacillus thuringiensis. Las proteínas Vip tienen propiedades pesticidas contra algunas plagas de la familia de los lepidópteros. Este documento pretende hacer una recopilación de información y datos relevantes para la evaluación general del riesgo ambiental de la proteína Vip3Ca3 cuando se produce en organismos modificados genéticamente como E. Coli y la planta de maíz GM.

Bacillus thuringiensis es una bacteria del suelo, aunque se encuentra en todo el entorno. Los pesticidas proteicos producidos por B. thuringiensis muestran una gran variedad en relación con el modo de acción, la especificidad del objetivo y el mecanismo de expresión. Proteínas plaguicidas expresadas por las cepas de B. thuringiensis incluyen compuestos antifúngicos, δ-exotoxinas, 3 y δ-endotoxinas, que incluyen la proteína Cry y Cyt, que no están Bacillus thuringiensis es una bacteria del suelo, aunque se encuentra en todo el entorno. Los pesticidas proteicos producidos por B. thuringiensis muestran una gran variedad en relación con el modo de acción, la especificidad del objetivo y el mecanismo de expresión. Proteínas plaguicidas expresadas por las cepas de B. thuringiensis incluyen compuestos antifúngicos, δ-exotoxinas, 3 y δ-endotoxinas, que incluyen la proteína Cry y Cyt, que no están estructuralmente relacionados sino que provienen de la misma bacteria. Las proteínas Cry se llaman así porque se almacenan en forma de cristales paraesporales durante la formación de la espora, a diferencia de la nueva proteína que fue producida por B. thuringiensis durante su fase vegetativa de crecimiento, además de durante la etapa de esporulación, así que fue llamada proteína insecticida vegetativa (Vip). Además, mientras que las proteínas Cry se aíslan en forma de cristales, las proteínas VIP son secretadas por las bacterias y se pueden aislar directamente del medio de cultivo. relacionados sino que provienen de la misma bacteria. Las proteínas Cry se llaman así porque se almacenan en forma de cristales paraesporales durante la formación de la espora, a diferencia de la nueva proteína que fue producida por B. thuringiensis durante su fase vegetativa de crecimiento, además de durante la etapa de esporulación es donde fue llamada proteína insecticida vegetativa (Vip). Mientras que las proteínas Cry se aíslan en forma de cristales, las proteínas VIP son secretadas por las bacterias y se pueden aislar directamente del medio de cultivo.

Se ha determinado que, en realidad, hay diversas variantes de Vip que se clasifican en tres clases de acuerdo a la similitud de la secuencia de aminoácidos: VIP1, VIP2 y Vip3. De éstos, el grupo cuyas propiedades insecticidas son más eficientes es el Vip3. Los miembros de la familia Vip3 caracterizado hasta la fecha muestran actividad contra lepidópteros, y varios de ellos no compiten con las proteínas Cry de sitios de unión. Se clasifican en dos subfamilias (Vip3A y Vip3B), y algunos son especialmente tóxicos para las especies con poca susceptibilidad a varias proteínas Cry. Todas estas características han hecho Vips con un objetivo de investigación para la ampliación de la gama de huéspedes de B. thuringiensis para bioplaguicidas basados en y para la gestión de la resistencia de los insectos a proteínas de B. thuringiensis.

Relación entre Vip3A y Vip3C
El grupo taxonómico de proteínas que Vip se utiliza actualmente en la producción de plantas de cultivos transgénicos resistentes a los insectos es VIP3Aa. Vip3Aa1 puede variar en tamaño de 62 a 66 kDa entre diferentes proteínas Vip3 y en ocasiones se conoce como el "núcleo resistente a tripsina". Además, las proteínas Vip3C mantienen sólo uno de los tres residuos de estabilizar el dominio C terminal descrito para Vip3Aa1 (5). Este mayor divergencia hacia el extremo C-terminal podría indicar limitaciones funcionales más bajos y, en consecuencia, más que la permisibilidad de sustituciones no sinónimas.

Para una selección preliminar de las propiedades insecticidas del Vip3Ca (rango de hospederos y toxicidad), Vip3Ca3 fue elegido debido a sus altos rendimientos, expresados en Escherichia coli, se purificó en columna, cuantificados por densitometría, y se utiliza para desafiar las larvas de 10 especies de lepidópteros diferentes. Los bioensayos se realizaron con larvas neonatas que se colocaron sobre una superficie contaminada con dieta artificial. Se ha prestado mucha atención a los posibles efectos de las proteínas de B. thuringiensis en la mariposa monarca (Danaus plexippus), que no es un lepidóptero plaga en América del Norte. Los estudios han demostrado que la VIP3Aa proteínas no son tóxicos para esta especie de mariposa. Sin embargo, las diferencias entre la Vip3A y la Vip3C son tales que no es posible determinar exactamente la toxicidad del plaguicida para la mariposa sin hacer prueba. Bioensayos preliminares de larvas de 10 especies de lepidópteros diferentes indicaron que Vip3Ca3 causó más de 70% de mortalidad en cuatro especies después de 10 días a 4 g/cm2. Pocos cambios en los sitios de procesamiento proteolítico Vip3Ca pueden modificar o bien la actividad de la proteína o la gama de huéspedes es incierto, pero diferentes proteínas Vip3 han demostrado propiedades insecticidas muy distintas. Por ejemplo, dos de las especies sometidas a prueba mostraron muy baja susceptibilidad a la Vip3Ca3. Uno de ellos era Ostrinia nubilalis, para el que no hay efectos tóxicos de cualquiera de las proteínas VIP3Aa que ensayaron hasta ahora han sido reportados. El otro era de L. botrana, que ha sido desafiado con Vip3 por primera vez.

Mecanismo de la actividad insecticida de Vip3
Un requisito previo para la actividad insecticida de Vip3Aa es una proteolisis enzimática que se encuentra en el intestino del insecto. Curiosamente, las proteínas Vip3 se procesan por los fluidos en el intestino del insecto y llegan a la forma activa, independientemente de si el insecto es susceptible a la toxina. Una vez que la proteína Vip3 se encuentra en la forma activa, que se une a la membrana vesicular de la mucosa de la enana de las especies sensibles. El sitio de unión no es el mismo sitio en los diferentes tipos de Vip3 y la conexión con el intestino se correlaciona con la toxicidad. Después de la unión, Vip3 causa parálisis del intestino, seguido por la lisis de las células epiteliales del intestino, supuestamente a causa de una interferencia del potencial transmembrana, lo que resulta en la muerte de las células. La proteína activada puede formar poros transmembrana, y se considera que estos poros contribuyen a la lisis y la muerte de las células epiteliales del intestino medio.

Sondas en organismos no objetivo (ONT)
Ha habido sondas de algunas proteínas Vip3 para determinar su daño ambiental, específicamente para ver si son un riesgo para los organismos o plagas. Sólo el Vip3Aa se han utilizado en plantas modificadas genéticamente y sobre la base de la información recuperada, es posible hacer inferencias acerca de los efectos generales de Vip3, pero recordando que el cambio de propiedades en diferentes ramas de Vip. Las proteínas Vip3Aa tienen propiedades insecticidas contra lepidópteros del insecto, y cuando se utiliza en los cultivos modificados genéticamente, las proteínas se dirigen a plagas de insectos lepidópteros para reducir el daño de los alimentos. Se denominan organismos no objetivos (ONT) a los organismos de medio ambiente, directa o indirectamente expuesta a las proteínas Vip, que no son plagas en el sistema agrícola.

La exposición directa se produce cuando las trenzas se alimentan de los tejidos de cultivos vivos o desechos de los cultivos que se encuentran en el suelo o en el subsuelo. La exposición indirecta ocurre cuando un organismo se alimenta de otro organismo que ha consumido a los tejidos de las plantas que contienen proteínas Vip3. Se han presentado los datos para mostrar que algunos organismos expuestos a la proteína VIP3Aa en el medio ambiente, ya sea directa o indirectamente, no sufran daños. Las decisiones regulatorias se han derivado de la amplia historia de la utilización de insecticidas para las formulaciones de los microbios de B. thuringiensis, así como los datos recopilados de las pruebas de campo de cultivos transgénicos que producen uno de las proteínas VIP3ca3. Estos datos han demostrado que las proteínas Vip3Aa son especialmente activos contra el subgrupo de plagas de lepidópteros que consumen los cultivos y que son seguros para las especies vertebradas y otros ONT. Sin embargo, debido a que el experimento se realizó con Vip3Aa es que podría ser un comportamiento diferente de Vip3Ca3.

Vías de exposición del medio ambiente
Las decisiones reguladoras, en general, tienen en cuenta tres rutas principales de la exposición, además del contacto directo con la planta o bacteria que expresa una de las proteínas Vip3: la exposición al polen contiene Vip3, la exposición a la Vip3 depositada en el suelo por el material del objeto en descomposición y exposición a través de los herbívoros que se alimentan de la planta o bacteria con la proteína.

En algunos países como los Estados Unidos, requieren datos relacionados con la longevidad de las proteínas Bt. en el suelo, y los datos sugieren que Vip3Aa se degrada rápidamente una vez liberado del tejido vegetal en descomposición, que no es probable que persista o acumularse en el suelo. Autoridades reguladoras han considerado el impacto potencial de la proteína VIP3Aa en poblaciones naturales de las trenzas y determinaron que los efectos adversos son en poco probable en las ONT, por diversas razones. Al principio, las proteínas Vip3Aa tienen un estrecho espectro de actividad plaguicida, pero no hay información que confirma que lo mismo ocurre con todas las proteínas Vip3. En segundo lugar, en los estudios de nivel I se ha demostrado también que las proteínas Vip3Aa tiene ningún efecto observable sobre las especies de vertebrados acuáticos ni representativos. En cuarto lugar, los niveles de Vip3Aa utilizados en estas pruebas de nivel I eran mucho más altos que los medidos en la producción de plantas y bacterias.Además, en comparación con el control de los insectos a través de vip3, el control de insectos de costumbre, que utiliza pesticidas químicos, altera la diversidad de las especies de una manera significativa y daños a especies ONT. Pero no es prudente olvidar los grandes efectos del tiempo que Vip3 puede tener en forma inmediata depredadores de las plagas.

Conclusión
Proteínas insecticidas vegetativas (VIP) son proteínas capaces de Bacillus thuringiensis que no comparten homología de secuencia con proteínas Cry conocidas y muestran actividad insecticida contra una amplia variedad de lepidópteros y coleópteros y algunas plagas de insectos chupadores de savia. Estudios de campo indican que el cultivo de plantas y otros productores que expresan Vip3 no afecta a la abundancia de los artrópodos que no son plagas, con la posible excepción de los depredadores de las plagas específicas. En conjunto, estos resultados indican que es poco probable que las proteínas Vip3Aa tengan efectos negativos en las poblaciones naturales de organismos, con excepción de las plagas de lepidópteros de los cultivos, y probablemente no habría resultados similares en general para proteínas similares Vip3.

1.Revisión de la seguridad ambiental de Vip3Aa. Center for Environmental Risk Assessment, ILSI Research Foundation. July 15th, 2012.
2.Vip3, a novel class of vegetative insecticidal proteins from Bacillus Thuringiensis. Instituto de Agrobiotacnología CSIC-UPNA, Spain, 2012.
3.Ministerio de agricultura, alimentación y medioambiente.
4.http://www.glfc.forestry.ca/bacillus/BtSearch.cfm(The Bacillus thuringiensis toxin specificity database)
5.http://cfs.nrcan.gc.na/projects/119/2(The Bacillus thuringiensis toxin project)















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