Team:CIDEB-UANL Mexico/WetLab-Notebook/Español

Mayo, 23, 2013
El día de hoy comenzamos oficialmente con el trabajo en el laboratorio. Nosotros resuspendimos todos los biobricks que íbamos a usar y transformar después. También transformamos un control positivo de 1ng/ µL que no era un biobrick.

Mayo, 24, 2013
El día de hoy checamos placas de Petri y el control positivo trabajado pero las células con los biobricks no crecieron. Nosotros cuantificamos el ADN con el nanodrop pero los resultados obtenidos no fueron seguros e inexactos..

Mayo, 29, 2013
El día de hoy hicimos células competentes y transformamos 4 cadenas de DNA que no eran biobricks y 2 biobricks que no estaban en el plan de construcción.

Mayo, 30, 2013
Las células competentes funcionaron muy bien, los 4 ADN crecieron con una eficiencia de 1.27x10 ^ 6 de las células. Los otros 2 biobricks no crecieron de nuevo. Intentamos volver transformar los biobricks con las nuevas células.

Mayo, 31, 2013
Hoy tenemos células de GFP, YFP y PPC con la etiqueta de degradación. Hemos observado las células en el microscopio, la GFP con la etiqueta de degradación parecía ser mejor que la YFP y el PP. Además, hoy hemos transformado los plásmidos pSB1T3, pSB1C3 y pSB1K3 que nos fueron enviados acompañados por los biobricks. Recogimos las colonias de los reporteros y los colocamos en un tubo de ensayo con medio LB.

Image 1. Bacteria with GFP under the microscope.

Junio,01,2013
Sólo tenemos los plásmidos pSB1K3 y pSB1C3. Recogimos las colonias de ambos plásmidos y los colocamos en un tubo de ensayo con medio LB.

Junio, 03, 2013

Image 2. Finally we have bacteria in tubes. We are ready to do our first miniPrep

Hicimos minipreparación de ADN plasmídico de los 3 reporteros: GFP, YFP, CFP y los 2 plásmidos pSB1K3 y pSB1C3.

Image 3. Biobricks are ready after the mini Prep.

Corrimos el gel de electroforesis con los 5 ADN. Además, hemos transformado los ADN sintéticos que acaba de llegar donde están el PCCI y plásmidos PUC-57. También este día, recogemos algunas colonias de las muestras de las vajillas vajilla 5-14o, 5-4E y 5-14I, que fueron los mismos reporteros que los utilizados en el MiniPrep, pero estas muestras procedían de muestras anteriores que fueron del equipo iGEM pasado. Estos se almacenan en la incubadora.

Junio, 04, 2013
Tenemos una gran cantidad de colonias de PCCI y muy pocas de la PUC-57. Como las colonias con la cI BioBrick no crecieron, la volvimos a transformar además de un poco más de la PUC-57. También hemos clonado células para tener más células competentes. Este día nos dimos cuenta de que las colonias de los reporteros que recogimos el día pasado no crecieron. Una vez más el día de hoy, las colonias de GFP, CFP y YFP y también la PCC1 y PUC-57 fueron recogidas y se insertaron en otros tubos con otro medio LB, y de nuevo se almacenaron en la incubadora.

Image 4. Synthetic DNA's arrived today.

Junio, 05,2013
No somos capaces de hacer células competentes porque las células no han crecido. Ninguna de las colonias creció. Hemos clonado de nuevo las placas de Petri de PCCI, PUC-57 y lo intentamos de nuevo con el represor cI BioBrick, en los tubos de ensayo mediano con LB .Con el ADN del MiniPrep, hecho hace dos días, la caracterización se llevó a cabo con el fin de obtener finalmente las piezas y para que pudiéramos ser capaces de unir a los genes. Los reporteros fueron cortados, sin embargo la electroforesis en gel de agarosa no mostró un buen resultado.

Junio, 06, 2013
Tenemos bacterias en los tubos de ensayo, así que hicimos minipreparación de ADN plasmídico. También hemos clonado a partir de un tubo a otro con el fin de tener más células como una copia de seguridad. Este día, la caracterización se hizo de nuevo, ahora con más especificaciones con las enzimas. Esta vez, los cortes fue bien con las muestras 5-14I y 5-14G, porque la imagen del gel de agarosa mostró el tamaño correcto. También este día, MiniPrep se dio cuenta de que las muestras de la PCCI, PUC y 5-4E. El resultado de la electroforesis mostró un ADN muy degradado, pero aún así mostró un buen resultado.

Junio, 7, 2013
Hicimos minipreparación de ADN otra vez. El día de hoy, la electroforesis de Minipreps de ayer se hizo de nuevo y se mostró, como era de esperar, más la degradación del ADN. De todos modos, se decidió hacer los cortes de las partes, cada parte con las enzimas respectivas: - GFP se cortó con EcoI y SpeI - 5-4E se cortó con XbaI y PstI - PUCI se cortó con Ecol y SpeI Después de la electroforesis, los resultados no mostraron un buen corte y también mostraron el ADN muy degradado.

Image 5. Gel with the MiniPreps June 6th, 2013

Junio, 10, 2013
Hemos preparado una digestión con las enzimas de restricción con todas las piezas que íbamos a necesitar. Este día se hizo una replantación de reporteros GFP, CFP y YFP, y los plásmidos 1-5A y 1-3A en medio LB y se almacenaron en la incubadora. También se hizo una electroforesis con los cortes del viernes, que mostraron los mismos resultados.

Junio, 11, 2013
En este día, las colonias que fueron replantados ayer no crecieron, a pesar de esto, realizamos un MiniPrep en cada muestra. Los resultados de la electroforesis mostraron que sólo 3 de ADN fue bien, mientras que los otros mostraron un ADN débil. De todos modos, decidimos hacer los cortes con las enzimas de los 3 ADN que salieron bien. También este día, otra replantación se hizo con las mismas muestras de ayer.

Image 7. Gel with only PCC1. First time it worked.

Junio, 12, 2013
Los recortes que se hicieron ayer, fueron objeto de una electroforesis en gel de agarosa, los cortes mostraron los resultados esperados, excepto para el PCC1. Se decidió iniciar todos los Minipreps de nuevo, para tener un respaldo en caso que de ligadura no funcionara. Esto significa un MiniPrep de todas las muestras de reporteros, GFP, YFP y PPC; los plásmidos 1-3A y 5A-1, y la PUC, PCCI y muestras de 5-4E. Después de esto, los resultados en el gel de agarosa muestran un resultado muy débil con el ADN de las muestras. Hoy también ligamos las secciones:
Ligación 1:
Backbone 1-5A
Insert1 PUC-57
Insert2 5-4E
Buffer 4uL
Ligase 1uL
H2O mQ 0

Ligación 2:
Backbone 1-3A
Insert1 5-14G
Insert2 PCC1
Buffer 4uL
Ligase 1uL
H2O mQ 0

June 13th, 2013
No obtuvimos colonias debido a la baja eficiencia de las bacterias

June 14th, 2013
Hicimos minipreparación de DNA plasmídico.

June 17th, 2013
Cortamos DNA pero estaba degradado. Inoculamos de nuevo en tubos de ensayo.

June 18th, 2013
Hicimos miniprep de DNA plasmídico. Cortamos PCC1 para liberar fragmento. No funcinó.

June 20th, 2013
Transformamos la ligación que hicimos la semana pasada para ver si funcionarían con las células competentes.

June 21th, 2013

Obtuvimos colonias de ligaciones:D

Image 8. Ligation with the PCC1

Image 9. Ligation with the PUC-57

Principales Problemas y Mejoras
Se presentaron muchos problemas al estar trabajando en el laboratorio.
- Los BioBricks no trasnformaban al principio. Después de muchos intentos obtuvimos colonias de los que ibamos a utilizar.
- Los genes que fueron mandado a sintetizar llegaron muy tarde. Tuvimos que esperar a que llegaran para tener las partes completas. De cualquier manera, preparamos los gene que sí teníamos para que estuvieran listo a que llegaran los genes sintéticos.
- Uno de los genes no funcionó, el PCC1. Creemos que es por un problema en el sitio de corte para la enzima EcoRI. Llegamos a la conclusión porque después de varias pruebas de cortar con varias enzimas: EcoRI-SpeI y EcoRI-PstI.PEro no se liberó el fragmento. Intentamos cortar con XbaI y SpeI pero ya no había DNA y el que había estaba degradado. Continuaremos con las pruebas para la presentación del Jamboree.