Team:CIDEB-UANL Mexico/Safety-ProjectDocument/Español

Ensayo de Bioseguridad
El organismo utilizado en el proyecto es la E. Coli, que tiene el grupo de riesgo o nivel de bioseguridad de uno. Eso significa que es poco probable que cause enfermedad en seres humanos o animales y, por lo tanto, es seguro de usar. La proteína que se va a ser sintetizada es derivada de Beauveria bassiana y que también pertenece al grupo de riesgo uno. Al igual que cualquier microorganismo, B. bassiana tiene el potencial de actuar como un patógeno oportunista, pero como el estudio de la literatura demuestra, que infecciones de Beauveria son eventos muy raros. De todos modos, no hay necesidad de trabajar directamente con, B. bassiana, porque es sólo un organismos de los que se deriva la parte insecticida.

También existen algunos riesgos potenciales para los miembros del equipo mientras trabajan en el laboratorio. El laboratorio utilizado es un elemento básico de bioseguridad de nivel uno sólo se utiliza para la enseñanza básica y la investigación, es un banco de trabajo abierto. El único riesgo en este laboratorio es que los miembros del equipo no siguen las reglas de seguridad para todos los laboratorios de evitar causar un accidente. Si el resultado del proyecto, ya que se supone que debe hacer, no debe ser un peligro para cualquier público, si el producto no se ingiere. Si es ingerido, E. Coli causaría diarrea y un poco de fiebre dependiendo del paciente.

Sobre el impacto ambiental, la bacteria es modificada con el fin de causar la muerte de los insectos plaga, lo que significa que se reducirá la población de la plaga, que afecta de una u otra manera, un cambio en el medio ambiente. El insecticida también puede afectar a algunas especies de la misma familia, pero no todos, es difícil predecir el impacto y el peligro debido a la falta de información acerca de este nuevo insecticida, pero lo que descubramos acerca de los insectos que están expuestos al insecticida, lo haremos al determinar la cantidad que se verá afectado por el mismo.

El riesgo de un accidente en el laboratorio depende de la atención que los miembros del equipo tienen durante las prácticas. Las partes biológicas y organismos representan un riesgo si entran en contacto con el cuerpo. Estamos trabajando con las cepas de E. coli que se debilitan específicamente para uso en laboratorio. Por otro lado, existen algunos equipos y los productos químicos que representan un peligro si no se utilizan correctamente. Algunos productos químicos utilizados en el laboratorio representan un riesgo de seguridad para todos los miembros del equipo por eso se nos dio la instrucción de utilizar el material con el cuidado necesario. Lo mismo ocurre con los equipos de laboratorio, algunos no se pueden utilizar sin autorización de responsables.

Nos están abordando estas cuestiones en nuestro diseño del proyecto y el trabajo de laboratorio tomando las precauciones y el uso de equipo de seguridad a fin de evitar un accidente. Cada miembro del equipo es consciente del riesgo que significa el trabajo en el laboratorio. Cada uno sabe sobre las reglas de seguridad durante una práctica de laboratorio, ya que hemos tenido capacitación en bioseguridad ante las prácticas reales, incluso comenzadas. En ella hemos aprendido acerca de los procedimientos adecuados para llevar a cabo cualquier experimento, y también sobre algunas medidas de seguridad que se refieren el material que íbamos a utilizar. Cuando se usa bromuro de etidio (riesgos incluyen: Irritante para los ojos, la piel, mucosa y las vías respiratorias) nos aseguramos de la zona de investigación designada esté bien cerrada y se utiliza la protección necesaria. Al observar el ADN de colores, mediante el uso de los rayos UV, se utiliza una protección especial para los ojos. Mientras que la gestión de aparatos eléctricos y circuitos, todos los miembros del equipo se les dijo que manejarlos con mucho cuidado. Esta formación fue con el fin de evitar accidentes y para el éxito del proyecto.

Bioseguridad Ambiental respecto al Vip3
Las proteínas de Vip3 son originales de la bacteria Bacillus thuringiensis. Las proteínas Vip tienen propiedades pesticidas contra algunas plagas de la familia de los lepidópteros. Este documento pretende hacer una recopilación de información y datos relevantes para la evaluación general del riesgo ambiental de la proteína Vip3Ca3 cuando se produce en organismos modificados genéticamente como E. Coli y la planta de maíz GM.

Bacillus thuringiensis es una bacteria del suelo, aunque se encuentra en todo el entorno. Los pesticidas proteicos producidos por B. thuringiensis muestran una gran variedad en relación con el modo de acción, la especificidad del objetivo y el mecanismo de expresión. Proteínas plaguicidas expresadas por las cepas de B. thuringiensis incluyen compuestos antifúngicos, δ-exotoxinas, 3 y δ-endotoxinas, que incluyen la proteína Cry y Cyt, que no están Bacillus thuringiensis es una bacteria del suelo, aunque se encuentra en todo el entorno. Los pesticidas proteicos producidos por B. thuringiensis muestran una gran variedad en relación con el modo de acción, la especificidad del objetivo y el mecanismo de expresión. Proteínas plaguicidas expresadas por las cepas de B. thuringiensis incluyen compuestos antifúngicos, δ-exotoxinas, 3 y δ-endotoxinas, que incluyen la proteína Cry y Cyt, que no están estructuralmente relacionados sino que provienen de la misma bacteria. Las proteínas Cry se llaman así porque se almacenan en forma de cristales paraesporales durante la formación de la espora, a diferencia de la nueva proteína que fue producida por B. thuringiensis durante su fase vegetativa de crecimiento, además de durante la etapa de esporulación, así que fue llamada proteína insecticida vegetativa (Vip). Además, mientras que las proteínas Cry se aíslan en forma de cristales, las proteínas VIP son secretadas por las bacterias y se pueden aislar directamente del medio de cultivo. relacionados sino que provienen de la misma bacteria. Las proteínas Cry se llaman así porque se almacenan en forma de cristales paraesporales durante la formación de la espora, a diferencia de la nueva proteína que fue producida por B. thuringiensis durante su fase vegetativa de crecimiento, además de durante la etapa de esporulación es donde fue llamada proteína insecticida vegetativa (Vip). Mientras que las proteínas Cry se aíslan en forma de cristales, las proteínas VIP son secretadas por las bacterias y se pueden aislar directamente del medio de cultivo.

Se ha determinado que, en realidad, hay diversas variantes de Vip que se clasifican en tres clases de acuerdo a la similitud de la secuencia de aminoácidos: VIP1, VIP2 y Vip3. De éstos, el grupo cuyas propiedades insecticidas son más eficientes es el Vip3. Los miembros de la familia Vip3 caracterizado hasta la fecha muestran actividad contra lepidópteros, y varios de ellos no compiten con las proteínas Cry de sitios de unión. Se clasifican en dos subfamilias (Vip3A y Vip3B), y algunos son especialmente tóxicos para las especies con poca susceptibilidad a varias proteínas Cry. Todas estas características han hecho Vips con un objetivo de investigación para la ampliación de la gama de huéspedes de B. thuringiensis para bioplaguicidas basados en y para la gestión de la resistencia de los insectos a proteínas de B. thuringiensis.

Relación entre Vip3A y Vip3C
El grupo taxonómico de proteínas que Vip se utiliza actualmente en la producción de plantas de cultivos transgénicos resistentes a los insectos es VIP3Aa. Vip3Aa1 puede variar en tamaño de 62 a 66 kDa entre diferentes proteínas Vip3 y en ocasiones se conoce como el "núcleo resistente a tripsina". Además, las proteínas Vip3C mantienen sólo uno de los tres residuos de estabilizar el dominio C terminal descrito para Vip3Aa1 (5). Este mayor divergencia hacia el extremo C-terminal podría indicar limitaciones funcionales más bajos y, en consecuencia, más que la permisibilidad de sustituciones no sinónimas.

Para una selección preliminar de las propiedades insecticidas del Vip3Ca (rango de hospederos y toxicidad), Vip3Ca3 fue elegido debido a sus altos rendimientos, expresados en Escherichia coli, se purificó en columna, cuantificados por densitometría, y se utiliza para desafiar las larvas de 10 especies de lepidópteros diferentes. Los bioensayos se realizaron con larvas neonatas que se colocaron sobre una superficie contaminada con dieta artificial. Se ha prestado mucha atención a los posibles efectos de las proteínas de B. thuringiensis en la mariposa monarca (Danaus plexippus), que no es un lepidóptero plaga en América del Norte. Los estudios han demostrado que la VIP3Aa proteínas no son tóxicos para esta especie de mariposa. Sin embargo, las diferencias entre la Vip3A y la Vip3C son tales que no es posible determinar exactamente la toxicidad del plaguicida para la mariposa sin hacer prueba. Bioensayos preliminares de larvas de 10 especies de lepidópteros diferentes indicaron que Vip3Ca3 causó más de 70% de mortalidad en cuatro especies después de 10 días a 4 g/cm2. Pocos cambios en los sitios de procesamiento proteolítico Vip3Ca pueden modificar o bien la actividad de la proteína o la gama de huéspedes es incierto, pero diferentes proteínas Vip3 han demostrado propiedades insecticidas muy distintas. Por ejemplo, dos de las especies sometidas a prueba mostraron muy baja susceptibilidad a la Vip3Ca3. Uno de ellos era Ostrinia nubilalis, para el que no hay efectos tóxicos de cualquiera de las proteínas VIP3Aa que ensayaron hasta ahora han sido reportados. El otro era de L. botrana, que ha sido desafiado con Vip3 por primera vez.

Mecanismo de la actividad insecticida de Vip3
Un requisito previo para la actividad insecticida de Vip3Aa es una proteolisis enzimática que se encuentra en el intestino del insecto. Curiosamente, las proteínas Vip3 se procesan por los fluidos en el intestino del insecto y llegan a la forma activa, independientemente de si el insecto es susceptible a la toxina. Una vez que la proteína Vip3 se encuentra en la forma activa, que se une a la membrana vesicular de la mucosa de la enana de las especies sensibles. El sitio de unión no es el mismo sitio en los diferentes tipos de Vip3 y la conexión con el intestino se correlaciona con la toxicidad. Después de la unión, Vip3 causa parálisis del intestino, seguido por la lisis de las células epiteliales del intestino, supuestamente a causa de una interferencia del potencial transmembrana, lo que resulta en la muerte de las células. La proteína activada puede formar poros transmembrana, y se considera que estos poros contribuyen a la lisis y la muerte de las células epiteliales del intestino medio.

Sondas en organismos no objetivo (ONT)
Ha habido sondas de algunas proteínas Vip3 para determinar su daño ambiental, específicamente para ver si son un riesgo para los organismos o plagas. Sólo el Vip3Aa se han utilizado en plantas modificadas genéticamente y sobre la base de la información recuperada, es posible hacer inferencias acerca de los efectos generales de Vip3, pero recordando que el cambio de propiedades en diferentes ramas de Vip. Las proteínas Vip3Aa tienen propiedades insecticidas contra lepidópteros del insecto, y cuando se utiliza en los cultivos modificados genéticamente, las proteínas se dirigen a plagas de insectos lepidópteros para reducir el daño de los alimentos. Se denominan organismos no objetivos (ONT) a los organismos de medio ambiente, directa o indirectamente expuesta a las proteínas Vip, que no son plagas en el sistema agrícola.

La exposición directa se produce cuando las trenzas se alimentan de los tejidos de cultivos vivos o desechos de los cultivos que se encuentran en el suelo o en el subsuelo. La exposición indirecta ocurre cuando un organismo se alimenta de otro organismo que ha consumido a los tejidos de las plantas que contienen proteínas Vip3. Se han presentado los datos para mostrar que algunos organismos expuestos a la proteína VIP3Aa en el medio ambiente, ya sea directa o indirectamente, no sufran daños. Las decisiones regulatorias se han derivado de la amplia historia de la utilización de insecticidas para las formulaciones de los microbios de B. thuringiensis, así como los datos recopilados de las pruebas de campo de cultivos transgénicos que producen uno de las proteínas VIP3ca3. Estos datos han demostrado que las proteínas Vip3Aa son especialmente activos contra el subgrupo de plagas de lepidópteros que consumen los cultivos y que son seguros para las especies vertebradas y otros ONT. Sin embargo, debido a que el experimento se realizó con Vip3Aa es que podría ser un comportamiento diferente de Vip3Ca3.

Vías de exposición del medio ambiente
Las decisiones reguladoras, en general, tienen en cuenta tres rutas principales de la exposición, además del contacto directo con la planta o bacteria que expresa una de las proteínas Vip3: la exposición al polen contiene Vip3, la exposición a la Vip3 depositada en el suelo por el material del objeto en descomposición y exposición a través de los herbívoros que se alimentan de la planta o bacteria con la proteína.

En algunos países como los Estados Unidos, requieren datos relacionados con la longevidad de las proteínas Bt. en el suelo, y los datos sugieren que Vip3Aa se degrada rápidamente una vez liberado del tejido vegetal en descomposición, que no es probable que persista o acumularse en el suelo. Autoridades reguladoras han considerado el impacto potencial de la proteína VIP3Aa en poblaciones naturales de las trenzas y determinaron que los efectos adversos son en poco probable en las ONT, por diversas razones. Al principio, las proteínas Vip3Aa tienen un estrecho espectro de actividad plaguicida, pero no hay información que confirma que lo mismo ocurre con todas las proteínas Vip3. En segundo lugar, en los estudios de nivel I se ha demostrado también que las proteínas Vip3Aa tiene ningún efecto observable sobre las especies de vertebrados acuáticos ni representativos. En cuarto lugar, los niveles de Vip3Aa utilizados en estas pruebas de nivel I eran mucho más altos que los medidos en la producción de plantas y bacterias.Además, en comparación con el control de los insectos a través de vip3, el control de insectos de costumbre, que utiliza pesticidas químicos, altera la diversidad de las especies de una manera significativa y daños a especies ONT. Pero no es prudente olvidar los grandes efectos del tiempo que Vip3 puede tener en forma inmediata depredadores de las plagas.

Conclusión
Proteínas insecticidas vegetativas (VIP) son proteínas capaces de Bacillus thuringiensis que no comparten homología de secuencia con proteínas Cry conocidas y muestran actividad insecticida contra una amplia variedad de lepidópteros y coleópteros y algunas plagas de insectos chupadores de savia. Estudios de campo indican que el cultivo de plantas y otros productores que expresan Vip3 no afecta a la abundancia de los artrópodos que no son plagas, con la posible excepción de los depredadores de las plagas específicas. En conjunto, estos resultados indican que es poco probable que las proteínas Vip3Aa tengan efectos negativos en las poblaciones naturales de organismos, con excepción de las plagas de lepidópteros de los cultivos, y probablemente no habría resultados similares en general para proteínas similares Vip3.

1.Revisión de la seguridad ambiental de Vip3Aa. Center for Environmental Risk Assessment, ILSI Research Foundation. July 15th, 2012.
2.Vip3, a novel class of vegetative insecticidal proteins from Bacillus Thuringiensis. Instituto de Agrobiotacnología CSIC-UPNA, Spain, 2012.
3.Ministerio de agricultura, alimentación y medioambiente.
4.http://www.glfc.forestry.ca/bacillus/BtSearch.cfm(The Bacillus thuringiensis toxin specificity database)
5.http://cfs.nrcan.gc.na/projects/119/2(The Bacillus thuringiensis toxin project)