|
Protocolo de Laboratorio
Manipulación de las placas de ADN liofilizado
Este paso es para buscar y obtener la pieza deseada.
Procedimiento:
1.- Buscar en el registro de piezas el BioBrick
2.- Perforar el plato y añadir 10 ul de agua mQ
3.- Mezclar muy bien, y tomar el líquido a un tubo Eppendorf
Preparación de células competentes y su transformación
Esto es para preparar el plásmido en la bacteria con choque térmico
Procedimiento de transformación:
1.- Tome 100 ul de las bacterias a un tubo Eppendorf
2.- Añadir 2UL de ADN y se mezclan
3.- Poner en hielo de 20 a 30 minutos
4.- Poner los Eppendorfs con el agua a 42°C durante 1 minuto
5.- Llévelo a hielo durante 2 minutos
6.- Añadir LB y se incuba ellos por 20 minutos, luego ponerlos en placa de Petri a 37 ° C toda la noche
Inoculación en Placa de Petri y tubos de ensayo
Inoculación de bacterias en placas con agar y tubos de medio con los antibióticos
Procedimiento:
Para sembrar
1.- Tome las colonias en un tubo de ensayo con LB y el antibiótico
2.- Tome el aza se esteriliza y extender a las colonias en el plato.
3.- Incubar a 37 ° C durante 16 horas
Resiembra
1.- Añadir el antibiótico a un tubo de ensayo
2.- Tome con un aza una colonia
3.- Luego agitar el aza en el tubo, finalmente se incuba a 37 ° C
Minipreparación de ADN de plasmídico
Esto es para obtener sólo el ADN plasmídico de una colonia
Procedimiento:
1.- Añadir 1,5 ml de colonias a un Eppendorf, centrifugar 30 segundos y tirar el líquido a la basura con jabón.
2.- Añadir 200 ul de solución I, II y III en tiempos de 5 minutos, respectivamente, y después centrifugar la nueva solución.
3.- Pasar sobrenadante el líquido a Eppendorf que contiene 1 ml de alcohol al 100%
4.- Incubar a -20 ° C durante 10 minutos
5.- Centrifugar y tirar el líquido.
6.- Añadir 200 ul de etanol al 70% y mezclar muy bien
7.- Centrifuga de nuevo y arrojar el líquido
8.- Deje que el precipitado se incube a 37 ° C, a continuación, añadir 200 ul de agua mQ con RNasa y se mezcla
9.- Comprobar en el gel o guardarlo a 4 ° C
La cuantificación de ADN por espectrofotometría UV
Esto es para cuantificar el plásmido ADN extraído
Procedimiento:
1.- Tomar 1 ml de agua mQ en un Eppendorf
2.- Añadir 1 ul de ADN plasmídico
3.- Preparar el espectrofotómetro
4.- Pase el ADN para el espectrofotómetro
5.- Seleccionar la opción (ADN o ARN)
6.- Escribe la conferencia del espectrofotómetro a 260, 280 y 320, la relación 260/280 y la concentración
Caracterización del ADN de plásmido
Esto es para identificar la pieza que tenemos
Procedimiento:
1.- Preparar la mezcla
2.- Separar la mezcla en partes iguales
3.- Añadir el ADN y mezclar
4.- Se incuban las reacciones a 37 ° C durante 1 hora
5.- Utilice el gel para comprobar el resultado
Enzamblaje de piezas BioBrick
Procedimiento:
En este paso vamos a cortar el plásmido con las enzimas de restricción apropiadas para entregar el fragmento deseado y para pegar en otra bacteria.
1.- Preparar la mezcla
2.- Dirigir la mezcla en partes iguales y el ADN para mezclarlo.
3.- Se incuban las reacciones durante 1 hora
4.- Comprobar en el gel
5.- Guárdalo para su ligación
La ligación de partes genéticas
Este paso es para pegar la pieza deseada en la bacteria que vamos a utilizar.
Procedimiento:
1.- Tome en cuenta la concentración de cada uno de los ADN .
2.- Usar la calculadora para obtener las cantidades para la preparación de la mezcla de ligación a 20 ul
3.- Preparar la mezcla en el siguiente orden: agua MQ, Buffer, y el plásmido
4.- Hacer la mezcla y agregue la ligasa apropiada
5.- Se incuban las reacciones a 25 ° C
|
"
